آزمایشگاه میکروبیولوژی و حیوانات آزمایشگاهی

اگر برای تحقیقات و کارهای خود در رشته های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار، دارید این وبلاگ کمک حال شما خواهد بود. همچنین اگر نیاز به روش های آزمایش با حیوانات آزمایشگاهی هستید و یا به تهیه حیوانات آزمایشگاهی نیاز دارید این وبلاگ به شما کمک خواهد نمود.

ابزار های کار مهندسی ژنتیک  در آزمایشگاه عبارتند از :

1- باکتری بعنوان میزبان

2- پلاسمید به عنوان حامل ژن

3- آنزیم بعنوان وسیله برش و اتصال قطعات DNA   به یکدیگر

 تدوین: دکتر بابک براتی

مدرس دانشگاه, مولف کتاب آزمایشگاه میکروب شناسی و متخصص در زمینه بیوتکنولوژی ، میکروبیولوژی و نانوبیوتکنولوژی

 

*********************************** 

 فعالیتهای وبلاگ

 *********************************** 

 

آموزش میکروبیولوژی

 برگزاری سلسله کارگاه های آموزشی

 میکروب شناسی ، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی

  برای دانشجویان، علاقمندان و دانش آموزان دبیرستانهای برجسته کشور

 Email: barati1987@yahoo.com

 دوستانی که برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و یا حتی اجرای کامل پروژه دارند و یا نیاز به آزمایش روی حیوان آزمایشگاهی و تهیه آن دارند با ایمیل یا موبایل اینجانب تماس حاصل نمایند.

   به فرازی از فعالیتها توجه نمایید:

  • طراحی و سنتز پپتیدهای (آنتی میکروبیال و ...) مورد نظر طبق درخواست شما
  • پذیرش پروژه های مستقل و مشترک در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • برگزاری کارگاههای آموزشی نیمه خصوصی، خصوصی و گروهی در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • مشاوره در انجام پروژه های بیولوژی، میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی  و نانوتکنولوژی
  • پیشنهاد طرح و راهنمایی در انجام پروژه های تحقیقاتی در زمینه های بیولوژی، میکروب شناسی، بیوتکنولوژی و نانوبیوتکنولوژی
  • تدریس و آموزش دروس آزمایشگاهی میکروب شناسی ( قارچ شناسی، باکتری شناسی، میکروبیولوژی عمومی، میکروبیولوژی غذایی، میکروبیولوژی کاربردی و ...)
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش های بیولوژی، میکروب شناسی،  سلولی و مولکولی، مهندسی ژنتیک و نانوتکنولوژی
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش با حیوان آزمایشگاهی و تهیه ( خرید - فروش ) حیوانات آزمایشگاهی( موش - خرگوش - خوکچه هندی - ... )

 اگر برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار دارید می توانید با ایمیل و یا تلفن اینجانب دکتر بابک براتی تماس حاصل نمایند.

             barati1987@yahoo.com               TEL: 09384198788

 

 **********************************************************************************

          ژنوتیپ باکتریها

 هر باکتری بعنوان میزبان در کارهای مهندسی ژنتیک  قابل استفاده نمیباشد بلکه باکتری باید خصوصیاتی  داشته باشد.  . در ژنوم باکتریهای مهندسی شده  تغییراتی داده شده است (موتاسیونهایی در ژنوم آنها اتفاق افتاده است)  . این موتاسیونها ( تغییرات ) بصورت علامت اختصار ی سه حرفی در متن دیده میشوند .  هنگام مطالعه متن اگر علامت اختصاری  با فونت عادی نشان داده شده باشد  علامت اختصاری یک آنزیم یا پرونئین میباشد  و اگر علامت  اختصاری سه حرفی با فونت ایتالیک نوشته شده باشد علامت یک موتاسیون میباشد.

در ادامه توجه شما را به بعضی از خصوصیات ژنتیکی سلولهایی (باکتری ) که در مهندسی ژنتیک استفاده میشوند و موتاسیونهایی که در آنها دیده میشود  جلب میکنم . دانستن اطلاعات زیر برای یک مولکولار بیولوژیست ضروری میباشد:

F or F`( Fertility)) : اپی زومی که پیلی جنسی ایجاد میکند . قسمت هایی از کروموزوم E.coli مانند اپرون (  Lac - pro A)   روی F`  قرار دارد. برای آلوده کردن باکتری به فاژ M13 یا فاژ های کمکی ( M13K07 , R408 ) فاکتور F`  لازم میباشد. این فاکتور برای تولید DNA تک رشته ای از فاژ( فارمید ) مفید میباشد .

ْْْْْْْْْْْْْْْْْhsd R - این موتاسیون موجب کاهش خاصیت رستریکشن EcoK  میشود  اما روی متیلاسیون تاثیری ندارد. باکتری که دارای این موتاسیون باشد DNA  خارجی بدون اینکه توسط R.ENase نوع I هضم شود وارد آن  میشود.

hsd S  باکتری که دارای این موتاسیون باشد فعالیت متیلاسیون و رستریکشن آن  کاهش میابند.

mcr- ( Methyl Cytosine Restriction) این موتاسیون اختصاصا" روی هر دویا یکی ازسیستم های McrA و McrB تاثیر میکند. ژن McrA  روی کروموزوم E.coli  قرارداشته وکد کننده فعالیت Restriction - Methylation  اختصاصی برای CmCGG میباشد . ناحیه mcrB در روی کروموزوم حاوی دو ژن mcrB و mcrC است . محصول این دو ژن موجب تشکیل نوکلئاز وابسته به هترو دایمر GTP  میشود. سومین فعالیت mcr بنام mcrF  گفته میشود( به mrr مراجعه شود ). اگر در Dcm  تغییری ایجاد شده باشد با +Mcr  هضم نمیشود.

mrr- قسمتی از سیستم رستریکشن وابسته به متیلاسیون(MDRS)  است  . این ژن DNA  حاوی آدنین های متیله شده را هضم میکند. ژن mrr روی ترادف های حاوی سیتوزین متیله( CpG)   فعالیت Restriction  دارد. این فعالیت اشاره به mcrF  میباشد. اگر درDam , Dcm  یا EcoK  تغییری ایجاد شود  DNA  با   Mrr  مثبت ویا هرسیستم رستریکشن دیگر E.coli K12 هضم نمیشود.

proA - این موتاسیون فعالیت گاما گلوتامیل فسفات ردکتاز را کاهش میدهدو بیوسنتز پرولین ناقص میگردد. باکتری موتانت برای رشد خود به اسید آمینه پرولین نیاز  دارد.

proB - این موتاسیون موجب کاهش فعالیت آنزیم گاما گلوتامات کیناز شده وبه نقص بیوسنتز پرولین منجر میشود . باکتری موتانت برای رشد خودبه اسید آمینه پرولین نیاز دارد.

ara A - درژن سیستم ال- آرابینوز ایزومراز باکتری  موتاسیون رخ داده است و باکتری موتانت نمیتواند از آرابینوز استفاده کند.

araC - در ژن رگولاتوری ( پروتئین اکتیواتور/ رپرسور ) موتاسیون رخ داده است

galK - (galA) ژن ساختمانی گالاکتوکیناز است. باکتریهای موتانت نمی توانند گالاکتوز را مصرف کنند. این موتانتها از گالاکتوز Expression Vector   استفاده میکنند.

LacY- این موتاسیون موجب کاهش فعالیت گالاکتوز پرمئاز ( پروتئین M ) میشود و باکتری نمیتواند از لاکتوز استفاده کند .

recAI- این موتاسیون موجب کاهش نو ترکیبی هومولوگ و افزایش  پایداری DNA کلون شده میگردد. رشد این سویه ها کند است و کارآیی ترانسفر ماسیون آنها پایین است.

rpsL- درژن زیر واحد S12 ریبوزوم 30S موتاسیون ایجاد میشود که موجب مقاومت به استرپتومایسین میشود. این ژن بصورت StrA هم نوشته میشود.

e14- اپی زوم شماره 14 حاوی ژن mcrA1 میباشد و حذف آن موجب صفت McrA   منفی   در باکتری میشود. حذف e14  منجر به آللهای دیگر McrA میشود.

supE44- این موتاسیون موجب میشود که به جای UAG که کدون متوقف کننده  است اسید آمینه   Gln در زنجیره پپتیدی قرار بگیرد. این سویه ها حاوی ژن (gln V ) برای گلوتامین tRNA2 میباشند که برای رشد فاژها لازم میباشند.

xyLA - موتاسیونی که  درD- گزیلوز ایزومراز ایجاد میشودوباکتری موتانت نمی تواند گریلوز را مصرف کند.

LacIq- ایجاد موتاسیون در پروموتور i ( ژن رپرسور ) که منجر به تولید 10 برابر رپرسور لاکتوز میشود. این موتان برای توقف بیان ( اکسپرس ) ژن از طریق پروموتور لاکتوز مفید  میباشد.

amber codon - کدون UAG که متوقف کننده ( Termination )  سنتز پروتئین است بنام آمبر کدون گفته میشود.

Tn10- ترانسپوزونی که موجب مقاومت به تتراسیکلین میشود ( Tetr) .

endA -این موتاسیون بصورت غیر اختصاصی  DNA endonuclease I    را  غیر فعال میکند . این موتاسیون برای جدا کردن پلاسمید DNA  مفید میباشد و کیفیت آن را بهبود می بخشد.

gyrA96 -موتاسیون درژن زیر واحدA  آنزیم  DNA gyrase  ایجاد میشود و باکتری به نالیدیکسیک  اسید مقاوم میگردد.

 thi I(thi A)- موتاسیون درژن سنتز تیازول ایجادشده است وبرای رشد باکتری تیامین ( ویتامین B123 ) با منشاء خارجی نیاز میباشد.

supE - باکتری موتانت کدون UAG  ( کدون ختم زنجیره ) را بعنوان کدون گلوتامین شناسایی میکند. هنگام سنتز پروتئین وقتی با UAG مواجه شود اسید آمینه گلوتامین وارد زنجیره پلی پپتیدی میشود. کدون UAG بصورت عادی یک کدون متوقف کننده است .وکتور M13  برای کدون UAG درچندین ژن موجوددر ژنوم فاژ طراحی شده بود این وکتورها فقط درسویه های آزمایشگاهی ذرات فاژ تولیدمیکردند. ژن آنها بطورصحیح در باکتری های سویه وحشی ترجمه نمیشد (مانند باکتریهایی که در روده زندگی میکنند) وقادربه رشددرمحیط خارج از آزمایشگاه نبودند. این ایده موجب جلوگیری از آزادکردن باکتریهای مهندسی شده درمحیط گردید.

F`[traD36]- ژن TraD درانتقالDNA  ازطریق کنژوگاسیون دخالت دا (Fertility plasmid ) . ژن موتاسیون یافته ازکنژوگاسیون باکتری جلوگیری میکند. پلاسمید های F` هنگام کنژوگاسیون از یک سلول به سلول دیگر منتقل میشوند و یک پلاسمید مهندسی شده  میتواند به یک باکتری وحشی منتقل شود ( یعنی باکتری ترانسفرم شده از پتری دیش خارج شود ). موتاسیون traD36 با کاهش پدیده کنژوگاسیون یک نوع ایمنی   میباشد  که از ایجاد حادثه جلوگیری  میکند.

F`[ proAB+] - این موتاسیون موجب حذف ژنهای بیوسنتز پرولین از باکتری شده واین ژنها  در پلاسمید F` مستقر شده اند. بنا براین باکتری میتواند پرولین را سنتز کند و احتیاجی به اضافه نمودن پرولین به محیط کشت نمیباشد ( تا زمانی  که باکتری پلاسمید F`  داشته باشد ). اگر باکتری پلاسمید F` خود را از دست بدهد ( مثلا" وقتی باکتری مدت زیادی در کشت آگار نگهداری شود ) به proAB منفی تبدیل میشود و باکتزی فقط در حضور پرولین رشد میکند. اگرباکتری  پلاسمید   F`خود را از دست بدهد مدت زیادی نمیتواند پیلی جنسی بسازد وبا  فاژ M13  آلوده نمیشود. بنا برا ین کشت باکتری در محیط minimum که فاقد پرولین است انجام میگیرد و به این معنی  است که فقط سلولهایی که پلاسمید F`  دارند و به M13 آلوده میشوند میتوانند زنده بمانند.

F`[LacZΔM15] - lacZ ژن بتا گالاکتوزیداز است . ΔM15 یعنی این  نسخه از ژن LacZ فاقد کدونهای 41-11 است . کدونهای 41-11 مخصوص قسمتی از پروتئین LacZ هستند که بنام پپتید آلفا گفته میشود. در غیاب این پپتید آنزیم بتا گالاکتوزیداز ناقص است ( برای فعالیت آنزیم  ، سلول باید دارای ژن LacZ` باشد که برای Missing peptide کد شود) . ژن LacZ`  روی وکتور است وسلولهای حاوی این وکتورها  میتوانند ژن بتا گالاکتوزیداز کامل  تولید کنند، بنا بر این وکتور و سلول با همدیگر در پدیده Lac selection  همکاری دارند.

نقش ژن LacZ- این ژن مارکر انتخابی با کتری نوترکیب میباشد و 140 اسید آمینه آنزیم بتا گالاکتوزیدازباکتری E.coli  را کد میکند . ژن مذکورلاکتوزرا به گلوکز و گالاکتوز تبدیل میکند. پروتئینی که توسط LacZکد میشود به تنهایی برای تبدیل لاکتوز به گلوکز و گالاکتوز کافی نیست و با یک قطعه ثانوی که حاوی بقیه پروتئین بتا گالاکتوزیداز است کامل میشود و آنزیم فعال تولید میکند. این پپتید ثانویه توسط وکتور (برای ترانسفر ماسیون در آزمایش کلونینگ استفاده میشود ) سنتز   میشود . واکنش ترانسفرماسیون باکتری با وکتورحاملLacZ`  روی پلیت آگار حاوی )  X-gal    5- برومو، 4 -کلرو، 3 - ایندولیل - بتا گالاکتوپیرانوزید ) که آنالوگ لاکتوز  است پخش میشود.

........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 سیستم  Lac selection  بصورت زیر کار میکند: (Lac Operon)

سلولی که حاوی وکتور کلونینگ با یک ژن LacZ`  بکر ( دست نخورده ) است میتواند بتا گالاکتوزیداز را سنتز کند .  این آنزیم همراه با IPTG  که یک القا کننده   است X-gal  را به ترکیب آبی  رنگ برومو کلرو ایندولیل تبدیل میکند . این سلولها کلنی   آبی  رنگ  (فقط حاوی پلاسمید هستند )  یا پلاک آبی رنگ ( حاوی فاژ ) تولید میکنند. سلولهای نوترکیبی که ژن LacZ` آنها توسط Inserted DNA  تخریب شده است نمیتوانند بتا گالاکتو زیداز را سنتز کنند و کلنی   های سفید  یا پلاک های   شفاف تولید میکنند  ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 تدوین: بابک براتی