آزمایشگاه میکروبیولوژی و حیوانات آزمایشگاهی

اگر برای تحقیقات و کارهای خود در رشته های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار، دارید این وبلاگ کمک حال شما خواهد بود. همچنین اگر نیاز به روش های آزمایش با حیوانات آزمایشگاهی هستید و یا به تهیه حیوانات آزمایشگاهی نیاز دارید این وبلاگ به شما کمک خواهد نمود.

همانند سازی و کنترل پلاسمیدهای حلقوی باکتریایی

 

  تدوین: دکتر بابک براتی

مدرس دانشگاه, مولف کتاب آزمایشگاه میکروب شناسی و متخصص در زمینه بیوتکنولوژی ، میکروبیولوژی و نانوبیوتکنولوژی

 

*********************************** 

 

فعالیتهای وبلاگ

 

*********************************** 

 

آموزش میکروبیولوژی

 

برگزاری سلسله کارگاه های آموزشی

 

میکروب شناسی ، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی

 

 برای دانشجویان، علاقمندان و دانش آموزان دبیرستانهای برجسته کشور

 

Email: barati1987@yahoo.com

 

دوستانی که برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و یا حتی اجرای کامل پروژه دارند و یا نیاز به آزمایش روی حیوان آزمایشگاهی و تهیه آن دارند با ایمیل یا موبایل اینجانب تماس حاصل نمایند.

 

  به فرازی از فعالیتها توجه نمایید:

 

  • طراحی و سنتز پپتیدهای (آنتی میکروبیال و ...) مورد نظر طبق درخواست شما
  • پذیرش پروژه های مستقل و مشترک در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • برگزاری کارگاههای آموزشی نیمه خصوصی، خصوصی و گروهی در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • مشاوره در انجام پروژه های بیولوژی، میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی  و نانوتکنولوژی
  • پیشنهاد طرح و راهنمایی در انجام پروژه های تحقیقاتی در زمینه های بیولوژی، میکروب شناسی، بیوتکنولوژی و نانوبیوتکنولوژی
  • تدریس و آموزش دروس آزمایشگاهی میکروب شناسی ( قارچ شناسی، باکتری شناسی، میکروبیولوژی عمومی، میکروبیولوژی غذایی، میکروبیولوژی کاربردی و ...)
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش های بیولوژی، میکروب شناسی،  سلولی و مولکولی، مهندسی ژنتیک و نانوتکنولوژی
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش با حیوان آزمایشگاهی و تهیه ( خرید - فروش ) حیوانات آزمایشگاهی( موش - خرگوش - خوکچه هندی - ... )

 

 اگر برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار دارید می توانید با ایمیل و یا تلفن اینجانب دکتر بابک براتی تماس حاصل نمایند.

 

            barati1987@yahoo.com               TEL: 09384198788

 

 

 

**********************************************************************************

 

 

همانند سازی و کنترل پلاسمیدهای حلقوی باکتریایی

 

تدوین : دکتر بابک براتی  

 

چکیده

 یکی از ویژگی های اصلی پلاسمیدهای باکتریایی این است که قادرند به صورت اجزای ژنتیکی و به طور کنترل شده در داخل سلول میزبان همانند سازی نمایند. بنابراین می توان از این پلاسمیدها برای شناسایی مکانیسم های موجود در همانند سازی DNA و بررسی پل های ارتباطی میان همانند سازی DNA و سایر وقایع مهم در چرخه سلولی استفاده نمود. در این مقاله ، همانند سازی و کنترل آن در پلاسمیدهای حلقوی مورد بحث قرار گرفته است.  همانند سازی پلاسمید دارای سه مرحله است : شروع ،‌ ادامه و پایان. ناتوانی آنزیم های DNA پلیمراز برای شروع همانند سازی ... سبب می شود تا نیاز به ساخت یک پرایمر مجزا به وجود آید. این مشکل در پلاسمیدهای حلقوی  به دو صورت برطرف شده است :

 1) باز شدن رشته ها و ساخت پرایمر RNA (همانند سازی تِتا و همانند سازی جابجایی رشته ها)  

 2) بریده شدن یکی از رشته های DNA برای ایجاد یک انتهای OH-3 (همانند سازی حلقه چرخان)           

 

 مرحله شروع همانند سازی اغلب به واسطه یک یا چند پروتئین آغازگر کُد شده توسط پلاسمید انجام می شود. این پروتئین ها ، توالی های DNA ای خاصی را بر روی پلاسمید شناسایی و نقطه آغاز همانندسازی (یا مبدأ همانند سازی) را تعیین می نمایند. در برخی موارد این پروتئین ها به طور مستقیم در ساخت پرایمر نیز شرکت می کنند. همچنین این پروتئین های آغازگر می توانند نقش یک راهنما را در تشکیل مجموعه همانند سازی  (Replisome) میزبان در نقطه آغاز ایفا نمایند. مرحله ادامه همانند سازی پلاسمیدها اساساً توسط DNA پلیمراز III (و در برخی موارد توسط DNA پلیمراز I در مراحل اولیه) و سایر پروتئین های موجود در مجموعه همانند سازی میزبان صورت می گیرد. پایان همانند سازی دارای مفاهیم و نیازمندی های خاصی برای شروع مجدد همانند سازی است که مطالعه درباره آن ها آغاز شده است. مرحله آغاز همانند سازی دارای نقش کنترلی نیز می باشد زیرا   مکانیسم های کنترل همانند سازی در این مرحله صورت می گیرد. هدف از این کنترل آن است که غلظت  مولکول های پلاسمیدی در توده باکتریایی در حال رشد ثابت نگه داشته شود و یا به عبارت دیگر همانند سازیمخزن پلاسمیدی هم گام با همانند سازی توده باکتریایی صورت گیرد. مولکول هایی که به طور مستقیم در کنترل همانند سازی پلاسمید دخیل هستند عبارتند از :

 1) RNA مکمل (Antisense RNA) و توالی های DNA ای (ایترون ها [Iteron])

   یا

 2) RNA مکمل و پروتئین های دخیل در کنترل همانند سازی

 

 مولکول های کنترلی بر طبق نسخه های پلاسمیدی موجود ، میزان همانند سازی پلاسمید در هر چرخه سلولی را در حد وسط نگه داشته و می توانند هر گونه انحراف از این میزان را شناسایی و متعادل نمایند. اکثر اطلاعات جدید درباره همانند سازی پلاسمید و کنترل آن بر اساس نتایج بررسی هایی می باشد که بر روی کشت خالص باکتری ها  تحت شرایط ثابت رشد صورت گرفته است. این اطلاعات در شناخت پارامترهای مهم مورد نیاز برای درک ابقاء  این عناصر ژنتیکی در توده های مختلط باکتریایی و تحت شرایط محیطی مؤثر می باشد.     ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 مقدمه

 پلاسمیدها ، مولکول های DNA خارج کروموزومی هستند که دارای ویژگی تعداد رونوشت ها در سلول میزبان   می باشند. این واحدهای قابل همانند سازی در گونه هایی از سه سلسله موجودات زنده جهان یعنی باکتری ها ،  آرکی باکترها و یوکاریوت ها یافت شده اند. ممکن است پلاسمیدها مقدار قابل توجهی از کل محتوای ژنومی یک موجود زنده را تشکیل دهند ، به طور مثال بیش از 25 درصد از ماده ژنتیکی سلول در برخی از اعضای سلسله آرکی باکترها از پلاسمید تشکیل شده است. پلاسمیدها قادرند توسط نوترکیبی یا ترانهش (Transposition) ، ژن ها را در کنار یکدیگر قرار داده و منتقل نمایند و در نتیجه باعث تغییرات ژنتیکی در توده های باکتریایی شوند. به دلیل این که پلاسمیدها قادرند توسط مکانیسم های گوناگون وارد  میزبان های جدید شوند می توان آن ها را یک مخزن DNA خارج کروموزومی در نظر گرفت که بین توده های مختلف باکتریایی به اشتراک گذاشته شده است. وفور اطلاعات ژنتیکی حمل شده توسط پلاسمیدها ، تأثیر آن ها در اجتماعات میکروبی و پتانسیل این عناصر برای استفاده به عنوان ناقل های طبیعی کلونینگ باعث افزایش تحقیقات   (نه تنها تحقیقات بنیادی بلکه پژوهش های بالینی ،‌ زیست فناوری و محیطی) بر روی پلاسمیدها شده است. سه فاکتور مهم در توسعه تحقیقات بر روی پلاسمیدها عبارت است از :

 1) سازماندهی ژنتیکی پلاسمیدها به طور آشکارا ساده می باشد.

 2) می توان پلاسمیدها را به راحتی تخلیص و در محیط خارج از سلول(in vitro) دست ورزی نمود.              

 3) به دلیل این که پلاسمیدها ، عناصر غیر ضروری هستند در نتیجه دستکاری آن ها آشکار نمی شود و در واقع دارای عواقب زیان آور برای سلول های میزبان نمی باشد.

  ویژگی که باعث توصیف بهتر پلاسمیدها می شود این است که پلاسمیدها به طور مستقل و تحت کنترل پلاسمیدی همانندسازی می کنند. بررسی همانندسازی پلاسیمدها و فرآیند کنترل همانندسازی آن ها منجر به کشفیات برجسته (همانند وجود antisense RNA ها) و درک مکانیسم های موجود در همانندسازی DNA ، اندرکنش های ماکرومولکولی و مکانیسم کنترل بیان ژن شده است. توانایی برخی پلاسمیدها برای عبور از میان موانع ژنتیکی موجود در میان موجودات زنده گوناگون باعث مطرح گردیدن مسائلی درباره مکانیسم های کلی حاکم بر همانندسازی و ارتباط میان فاکتورهای همانندسازی پلاسیمد و دستگاه همانندسازی DNA سلول میزبان شده است. این ارتباط میان میزبان و پلاسمید باعث جلب توجه پژوهشگران حوزه تکامل و محیطی شده است. همچنین حوزه های  میکروب شناسی بالینی و زیست فناوری آشکارا نیازمند تحقیقات بر روی محدوده میزبان پلاسمیدها هستند. پلاسمیدها علیرغم همانندسازی مستقل ، به طور گسترده از دستگاه همانندسازی سلول میزبان استفاده می کنند. از اینرو مطالعه همانندسازی آن ها به شناسایی مکانیسم های موجود در همانندسازی کروموزوم کمک خواهد نمود.

 

مکانیسم های همانندسازی پلاسیمد

 سه مکانیسم کلی همانندسازی برای پلاسمیدهای حلقوی وجود دارد که عبارتند از : مکانیسم تِتا ، تعویض زنجیره و حلقه چرخان (RC). افزایش سابقه تحقیقات بر روی پلاسمیدها منجر به ایجاد این تفکر عمومی شده است که همانندسازی تتا بیشتر در واحدهای همانندسازی باکتری های گرم منفی صورت می گیرد تا باکتری های گرم مثبت و عکس این موضوع در مورد همانندسازی به روش حلقه چرخان دیده می شود. این باور احتملاً نادرست است. البته   به دلیل این که در حال حاضر دانش ما از همانندسازی تتا و حلقه چرخان به ترتیب بر پایه مطالعات بر روی واحدهای همانندسازی باکتری های گرم منفی و باکتری های گرم مثبت است می توان گفت که این اعتقاد صحیح است. همانندسازی تعویض زنجیره در پلاسمیدهای وسیع الطیف (دارای محدوه میزبانی وسیع) خانواده IncQ  دیده می شود. اندرکنش های مولکولی و ارتباطات عملکردی این سه نوع مکانیسم همانندسازی ، موضوعات اصلی  این مقاله هستند. پلاسمیدهای خطی هم در باکتری های گرم منفی و هم در باکتری های گرم مثبت یافت شده و دارای دو نوع ساختار هستند : پلاسمیدهای دارای یک ساختار سنجاق سر در هر انتها و پلاسمیدهایی که یک پروتئین به طور کووالانسی به انتهای5 آن ها متصل شده است. پلاسمیدهای خطی گروه اول توسط ساختارهای حدواسط   به هم پیچیده یا concatemeric و پلاسمیدهای گروه دوم ظاهراً توسط یک مکانیسم ایجاد پرایمر به واسطهپروتئین ها (شبیه به مکانیسم همانندسازی باکتریوفاژ Φ29) همانندسازی می کنند. البته شروع همانندسازی از یک نقطه آغاز داخلی در یک پلاسمید دارای پروتئین انتهایی گزارش شده است. پلاسمیدهای خطی قبلاً نیز مرور شده اندو در این مقاله مورد بحث قرار نخواهند گرفت. همانندسازی پلاسمید باکتری های گرم منفی به طور اختصاصی مورد بررسی قرار گرفته است.

 پلاسمیدها از لحاظ ساختار ژنتیکی دارای مناطق ضروری هستند که حاوی ژن ها یا موقعیت های ژنی دخیل در همانندسازی و کنترل آن می باشند. به طور کلی سازماندهی این مناطق ضروری شبیه سازماندهی ژنتیکی است که در مدل واحد همانندسازی یا reolicon توضیح داده شده است. علاوه براین پلاسمیدها ممکن است حاوی ژن هایی باشند که به صورت غیر ضروری در نظر گرفته می شود ولی در واقع این ژن ها می توانند برای عملکرد پلاسمید و  یا سلول میزبان مهم باشند. برخی از این ژن ها که غیر ضروری نامیده می شوند در فرآیندهایی مانند انتقال پلاسمید و گسترش آن در میان باکتری ها ، مقاومت به آنتی بیوتیک ها و فلزات سنگین ، مقاومت به تشعشعات رادیولوژیک و انتقال DNA به یوکاریوت های پیشرفته تر دخیل می باشند. در داخل منطقه ضروری پلاسمید می توان چندین ژن و توالی را مورد بررسی قرار داد :

 1) نقطه یا نقاط شروع همانندسازی (نوعاً oriنامیده می شود) که یکی از مشخصات هر واحد همانندسازی است.  

 2) بسیاری از پلاسمیدها ، پروتئینی را کد می کنند که در آغاز همانندسازی دخیل است و معمولاً پروتئین Rep  نامیده می شود. (این موضوع یک ویژگی کلی نمی باشد)

 3) ژن های پلاسمیدی که در کنترل همانندسازی پلاسمید دخیل می باشند.         

 وجود جایگاه های ... در ناحیه شروع همانندسازی که محل اندرکنش های پروتئین-DNA است نشان می دهد که یک آغازگر کد شده توسط پلاسمید مورد نیاز می باشد. این جایگاه های اختصاصی ، شاخص رده ای از واحد های همانندسازی است که با واحدهای همانندسازی بدون نیاز به آغازگرهای اختصاصی تفاوت دارند.       ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 همانندسازی توسط مکانیسم تتا

 همانندسازی به روش تتا عمدتاً در پلاسمیدهای حلقوی اولیه باکتری های گرم منفی مورد بررسی قرار گرفته است. البته این نوع همانندسازی در مورد پلاسمیدهای جدا شده از باکتری های گرم مثبت (مانند گروه Inc18 انتروکوک/استرپتوکوک  ، برخی واحدهای همانندسازی مربوط به لاکتو کوکوس ها و حداقل یک پلاسمید باسیلوس سوبتیلیس نیز شرح داده شده است. مراحل همانندسازی DNA به روش تتا عبارت است از : ذوب شدن زنجیره های مادری ، ساخت یک پرایمر RNA (pRNA) و شروع همانندسازی DNA توسط گسترش کووالانسی پرایمر RNA . ساخت DNA در یکی از رشته ها (رشته پیشرو) ، پیوسته و در رشته دیگر(رشته پیرو) ، ناپیوسته می باشد. البته به نظر می رسد که ساخت هر دو رشته به صورت پیوسته با یکدیگر صورت می گیرد. همانندسازی به روش تتا ممکن است از یک یا چند نقطه شروع آغاز شده و یک جهتی یا دوجهتی باشد. با مشاهده ساختارهای حدواسط این نوع همانندسازی توسط میکروسکوپ الکترونی (EM) ،  مولکول هایی به شکل تتا (θ) دیده می شود. اگر داخل ناحیه همانندسازی شده با آنزیم برش داده شود آن گاه مولکول هایی به شکل Y (چنگال) بدست خواهد آمد. همچنین می توان ساختارهای حدواسط همانندسازی را توسط الکتروفورز تک بُعدی یا دو بُعدی مورد بررسی قرار داد. این بررسی ها اطلاعاتی درباره ماهیت ساختارهای حدواسط همانندسازی ، جهت همانندسازی ، محل شروع و پایان همانندسازی و میزان پیوستگی میان سنتز رشته های  پیشرو و پیرو فراهم خواهد نمود.

 در مواردی استثنایی برخی پلاسمیدهای دارای همانندسازی به روش تتا به یک پروتئین آغازگر Rep (کد شده توسط پلاسمید) نیاز دارند. برخی واحد های همانندسازی نیز ممکن است در طی مراحل اولیه سنتز رشته پیشرو به  DNA پلیمراز I میزبان (DNA PolI) نیاز داشته باشند.

نقاط شروع همانندسازی- نقطه شروع همانندسازی را می توان به چندین صورت تعریف نمود :

 1) ناحیه حداقل فعال cisکه امکان همانندسازی مستقل پلاسمید را فراهم می نماید.

 2) ناحیه ای که زنجیره های DNA ذوب می شوند تا همانندسازی آغاز گردد.

 3) تکیه گاهی (یا چندین تکیه گاه) که سنتز رشته پیشرو از آن آغاز می شود.    

 نقاط شروع همانندسازی حاوی جایگاههایی هستند که برای اندرکنش پروتئین های کُد شده توسط پلاسمید یا میزبان مورد نیاز هستند.

1- خصوصیات کلی  

 در برخی موارد ، شروع همانندسازی DNA پلاسمید به یک پروتئین آغازگر Rep (کد شده توسط پلاسمید) خاص نیاز دارد. این موضوع به واسطه حضور توالی های اختصاصی در نقطه آغاز همانندسازی که دارای اندرکنش با  پروتئین های Rep هستند تأیید می گردد. بسیاری از نقاط آغاز همانندسازی در پلاسمیدهای دارای همانندسازی  به روش تتا دارای چندین ویژگی دیگر هستند : 1) یک ناحیه (نزدیک به نقطه شروع) غنی از بازهای AT که حاوی توالی های تکراری است و باز شدن رشته های DNA و همگذاری (تجمع) فاکتورهای آغاز همانندسازی (مربوط به میزبان) در آن صورت می گیرد.  2) یک یا چند جایگاه (جعبه های dnaA) برای اتصال پروتئین آغازگر DnaA میزبان. چندین توالی مربوط به متیلاسیون محدود (که در نقطه آغاز همانندسازی کروموزوم اشریشیا کولی ، oriC ، قرار دارد) نیز در نقطه آغاز همانندسازی پلاسمیدهایی همچون P1،   pSC101 یافت شده است. متیلاسیون برای همانندسازی ضروری نیست و عمدتاً در وقایع  پس از همانندسازی نقش دارد. توالی های متیلاسیون محدود (Dam methylation) در سایر واحد های همانندسازی پلاسمیدی وجود ندارند. بررسی های مقایسه ای سازماندهی ساختاری نقاط شروع بی نیاز  از پلیمراز I پیش بینی می کند که جایگاه اتصال Rep در داخل یک ناحیه DNA خمیده قرار داشته و DNA مربوط به توالی های تکراری غنی از AT به طور ذاتی صاف است. خمیدگی ذاتی DNA در جایگاه اتصال Rep ، خمیدگی های اضافی ایجاد شده در نقطه شروع توسط پروتئین های Rep را مساعد می نماید. همچنین نقاط شروع همانندسازی می توانند حاوی جایگاه هایی برای فاکتورهای دارای نقش ساختاری (مانند فاکتور دخول به کروموزوم میزبان یا IHF و فاکتور تحریک کننده عمل معکوس شدن یا FIS) باشند. این پروتئین های کد شده توسط میزبان ، نواحی oriگوناگون و یا نقاط شروع گوناگون در یک پلاسمید (به طور مثال در پلاسیمد R6K) را از لحاظ مکانی به یکدیگر نزدیک می کنند. جایگاه های DNA پلاسمید ، اجزای ضروری نقطه آغاز همانندسازی هستند زیرا برای سازمان دهی یک رپلیزوم (replisome) فعال مورد نیاز هستند. وجود جایگاه های DNA برای اتصال فاکتورهای ساختاری (که در نقطه آغاز همانندسازی پلاسمیدهای گوناگون یافت می شود) شبیه به وضعیتی است که در oriC وجود دارد. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

2- نقاط شروع حاوی ایترون (Iteron)

 در بسیاری از موارد نقطه آغاز همانندسازی مستقیماً حاوی توالی های تکراری است که ایترون نام دارد. این توالی ها،  جایگاه های اتصال برای پروتئین های Rep (کد شده توسط پلاسمید) بوده و دارای خاصیت کنترلی می باشند. همانطور که در ذیل توضیح داده شده است ، ایترون ها نه تنها برای همانندسازی بلکه برای کنترل همانندسازی پلاسمید نیز ضروری هستند. ایترون ها از میان پلاسمیدهایی که فقط در یک یا چند گونه از خانواده انتروباکتریاسه وجود دارند ، در چندین واحد همانندسازی مانند p1 ، F، pSC101 ، R6K ، Rts1 و pColIV-K30  مورد بررسی قرار گرفته اند. همچنین ایترون ها در پلاسمیدهای وسیع الطیف دارای همانندسازی تتا مانند RK2/RP4( ، pCU1 و pSa و پلاسمیدهای وسیع الطیف شرطی مانند pPS10  نیز یافت شده اند. توجه داشته باشید که حضور توالی های مستقیماً تکراری برای اتصال پروتئین های Rep فقط مربوط به پلاسمیدهای دارای همانندسازی تتا نیست زیرا حضور این توالی ها در پلاسمیدهای دارای همانندسازی حلقه چرخان یا تعویض زنجیره نیز گزارش شده است. در برخی پلاسمیدها (P1 ، F ، RK2 ، R6K ،‌ Rts1 و pColIV-K30) می توان ایترون ها را  در خارج از ناحیه شروع همانندسازی یافت. این ایترون ها برخلاف ایترون های موجود در ناحیه شروع همانندسازی برای آغاز همانندسازی ضروری نیستند ولی مانند ایترون های ناحیه شروع نقش مهمی در کنترل همانندسازی  ایفا می کنند. در پلاسمیدهای فاقد ایترون های کمکی ، ایترون های ناحیه شروع تنها لوکوس دخیل در کنترل همانندسازی هستند.  ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

  بابک براتی