آزمایشگاه میکروبیولوژی و حیوانات آزمایشگاهی

اگر برای تحقیقات و کارهای خود در رشته های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار، دارید این وبلاگ کمک حال شما خواهد بود. همچنین اگر نیاز به روش های آزمایش با حیوانات آزمایشگاهی هستید و یا به تهیه حیوانات آزمایشگاهی نیاز دارید این وبلاگ به شما کمک خواهد نمود.

پلاسمید ها

تدوین: دکتر بابک براتی

مدرس دانشگاه, مولف کتاب آزمایشگاه میکروب شناسی و متخصص در زمینه بیوتکنولوژی ، میکروبیولوژی و نانوبیوتکنولوژی

 

*********************************** 

 

فعالیتهای وبلاگ

 

*********************************** 

 

آموزش میکروبیولوژی

 

برگزاری سلسله کارگاه های آموزشی

 

میکروب شناسی ، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی

 

 برای دانشجویان، علاقمندان و دانش آموزان دبیرستانهای برجسته کشور

 

Email: barati1987@yahoo.com

 

دوستانی که برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و یا حتی اجرای کامل پروژه دارند و یا نیاز به آزمایش روی حیوان آزمایشگاهی و تهیه آن دارند با ایمیل یا موبایل اینجانب تماس حاصل نمایند.

 

  به فرازی از فعالیتها توجه نمایید:

 

  • طراحی و سنتز پپتیدهای (آنتی میکروبیال و ...) مورد نظر طبق درخواست شما
  • پذیرش پروژه های مستقل و مشترک در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • برگزاری کارگاههای آموزشی نیمه خصوصی، خصوصی و گروهی در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • مشاوره در انجام پروژه های بیولوژی، میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی  و نانوتکنولوژی
  • پیشنهاد طرح و راهنمایی در انجام پروژه های تحقیقاتی در زمینه های بیولوژی، میکروب شناسی، بیوتکنولوژی و نانوبیوتکنولوژی
  • تدریس و آموزش دروس آزمایشگاهی میکروب شناسی ( قارچ شناسی، باکتری شناسی، میکروبیولوژی عمومی، میکروبیولوژی غذایی، میکروبیولوژی کاربردی و ...)
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش های بیولوژی، میکروب شناسی،  سلولی و مولکولی، مهندسی ژنتیک و نانوتکنولوژی
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش با حیوان آزمایشگاهی و تهیه ( خرید - فروش ) حیوانات آزمایشگاهی( موش - خرگوش - خوکچه هندی - ... )

 

 اگر برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار دارید می توانید با ایمیل و یا تلفن اینجانب دکتر بابک براتی تماس حاصل نمایند.

 

            barati1987@yahoo.com               TEL: 09384198788

 

 

 

**********************************************************************************

 پلاسمید ها

همانطور که می دانید، به طور کلی ترکیب ژنتیکی سلول باکتریایی شامل باکتریوفاژهایی که قبلا در داخل کروموزوم قرار گرفته اند، نیز می باشد (پروفاژ). نکته مهمتر در این اصطلاح، تاثیر عناصر DNA ای خارج کروموزومی که پلاسمید نامیده می شوند روی فنوتیپ سلولی است. گر چه اینها به صورت جدا از باکتریوفاژها در نظر گرفته می شوند، اما نمی توان همیشه میان این دو مرز ثابتی قرار داد. تعدادی از باکتریو فاژها به کروموزم وارد نمی شوند لیکن در حالت پروفاژ جدای از مولکول DNA می باشند که در این صورت، واقعا پلاسمید می باشند. باکتریوفاژهایی همانند M13 نیز همچون پلاسمید ها همانند سازی می کنند و بالعکس برخی پلاسمیدها می توانند به روشی کارامد وارد کروموزوم شوند.

پلاسمید ها و فاژها یک بعد اضافی مهم در انعطاف پذیری پاسخ ارگانیسم ها به تغییرات محیطی شان مهیا می کنند، این تغییرات می توانند علیه (مانند حضور آنتی بیوتیک ها) یا بالقوه مساعد (قابلیت استفاده از مواد جدید) ارگانیسم باشند. این بعد اضافی شامل ویژگی های جانبی در همانند سازی  و تولید ساختارهای پایه ای سلول می باشند و به صورت اختیاری و فوق العاده هستند. شرکت در ویژگی های اضافی  به طور ویژه مهم است چرا که به راحتی می توانند بین سویه های خویشاوند یا بین گونه های مختلف انتقال پیدا کنند. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 برخی از خصوصیات باکتری ها توسط پلاسمید ها تعیین می شوند

 

مقاومت آنتی بیوتیکی

گسترده ترین مطالعات روی ویژگیهای پلاسمیدهای متحمل کننده که مقاومت دارویی ایجاد می کنند ، نجام شده است. بسیاری از باکتری ها با کسب پلاسمید به آنتی بیوتیک ها مقاوم می شوند. اگرچه به نظر می رسد که پلاسمید تحمل کننده مقاومت به برخی داروها نظیر نالیدیکسیک اسید و ریفامپین    نمی تواند رخ دهد (در این موارد مقاومت معمولا به وسیله جهش در ژنی که پروتئین هدف را کد می کند ، اتفاق می افتد) . ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیکی خیلی متنوع و زیاد هستند، که شامل پلاسمید های کد کننده بتا لاکتاماز تخریب کننده پنی سیلین تا پروتئین های غشایی تقلیل دهنده توده داخل سلولی تتراسایکلین، می باشند. پلاسمیدها این توانایی را دارند که از یک باکتری به باکتری دیگر  و حتی بین برخی از گونه های خیلی متفاوت انتقال یابند ودر انتشار با دامنه وسیع ژنهای مقاومت به آنتی بیوتیک به طور گسترده همکاری می کنند. باکتری ها می توانند به یک آنتی بیوتیک به طور مجزا هم به وسیله کسب کردن چندین پلاسمید مستقل  و هم به وسیله دریافت یک پلاسمید با چندین مقاومت تعیین کننده بر روی آن ،مقاوم  شوند. برخی از مثال ها در ادامه همین فصل مورد بحث قرار می گیرد. عقیده بر این است که ترانسپوزون ها نقش مهمی در توسعه مقاومت آنتی بیوتیکی  پلاسمید ها دارند که به وسیله انتشار جابجایی ژنهای مسئول بین پلاسمید های مختلف و یا از کروموزوم یک ارگانسیسم مقاوم طبیعی به داخل پلاسمید، ایفای نقش می کند. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

باید توجه داشت که مکانیسم های دیگری برای مقاومت آنتی بیوتیکی نیز رخ می دهد و چنین نیست که همیشه مقاومت، ناشی از پلاسمیدها باشد، بواقع بسیاری از باکتری های ایجاد کننده مشکلات عفونت های قابل انتقال بیمارستانی، هم مقاومت های ذاتی و هم مقاومت های آنتی بیوتیکی شان روی ژنهای کروموزومی هستند.

 

 کلی سین و باکتروسین

ویژگی دیگری که به وسیله برخی پلاسمید هاایجاد می شوند و به طور گسترده مطالعه شده اند، توانایی در تولید پروتئین دارای عملکرد آنتی باکتریال است که عموما بر علیه یک ارگانیسم با رابطه خویشاوندی عمل می کند. یک گروه ازاین پروتئین ها بوسیله سوش های E.coli تولید می شود و قادر است دیگر سوشهای E.coli را از بین ببردو به کلی سین معروف اند، سوش هایی که می توانند کلی سین را تولید کنند به کلی سینوژنیک معروف هستند. ژن کلی سین بوسیله پلاسمید حمل می شود (این پلاسمیدها ،COL پلاسمید نامگذاری می شوند) که با یک ژن ثانویه ایجاد کننده ایمنی، با یکدیگر عملکرد کلیسین را دارند، بنابر این حفظ سلول  در مقابل اثرات کشنده توسط خود سلول فراهم می شود.  COL پلاسمید ویژه  E.coliبه طور خاصی مهم می باشد چرا که  جزئیات اطلاعات آن درباره همانند سازی و کنترل در دسترس می باشد و همچنین به دلیل اینکه به طور عام بیشترین کاربرد در کلونینگ وکتورهای E.coli، بر پایه Col E1 یا خویشاوندان نزدیک به آن است . ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 عوامل تعیین کننده بیماریزایی

در فصل قبل چگونگی حمل ژنهاوتوانایی کد کنندگی توکسین ها توسط باکتروفاژهاو لزوم حضور آنها برای پاتوژنیسیتی در فاژها  مورد بررسی قرار گرفت. در تعدادی از گونه های باکتریایی، ژنهای توکسین بر روی پلاسمید بیشتر از فاژها حمل می شوند . برای مثال، برخی از سوش های E.coli قادر هستند ایجاد بیماری شبیه به اسهال کنند(هر چند ملایم تر). این سوش ها یک توکسین شناخته شده به نام LT را تولید می کند(توکسین ناپایداری که از توکسین متفاوت مقاوم به حرارت به نام ST ،تمییز داده می شود). توکسینLT  ارتباط نزدیکی با توکسین کلرا دارد ،در حالیکه این ژن در V.cholerae  توسط پروفاژ حمل می شود و ژن LT در E.coli توسط پلاسمید حمل می گردد.

پلاسمیدها علاوه بر این، ژنهای دیگری که در بیماری زایی ضروری هستند(یا تشدید کننده) را حمل می کنند. یکی از نمونه های بسیار جالب، پلاسمید بیماری زایی kb70 است که در گونه های یرسینیا می باشد. این پلاسمید درگونه های یرسینیا (همچون یرسینیا پستیس ،عامل بیماری طاعون ) یافت می شود و شایستگی توصیف تحت عنوان زرادخانه متحرک را دارند،اینهایک سیستم داخل شونده را کد می کنند که به باکتری این اجازه را می دهد که به طور موٍثری پروتئینها را به سلول های پاسخ دهنده ایمنی تزریق کنند و آنها را خلع سلاح کنندبه طوری که ارتباط آنها به هم زده مشود و حتی باعث مرگ آنها می شوند. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 پلاسمیدها در باکتری های گیاهی

یک نوع متفاوت بیماری زایی که در پاتوژن گیاهی Agrobacterium tumejaciens,  دیده می شود و باعث رشد توموری شکل همانند یک تاول تاجی شکل در برخی گیاهان می شود. به علاوه فقط سوش هایی که یک نوع پلاسمید ویژه (شناخته شده به نام Ti  plasmid برای القای تومور) را حمل می کنند، پاتوژنیک  می باشند و در این حال پاتوژنیسیتی وابسته به انتقال بخش خاصی از DNA مربوط به خود پلاسمید به داخل سلول های گیاهی است. اهمیت فوق العاده این پدیده به دلیل کاربرد آن در دستکاری ژنتیکی سلول گیاهی می باشد.

اعضای جنس Rhizobium نیز باعث عفونت گیاهان می شوند، گر چه در این مورد وابستگی به صورت همزیستی، بیشتر از بیماری زایی می باشد. این باکتری ها گره هایی بر روی ریشه گیاهان دو لپه ای ایجاد می کنند.تحت این شرایط باکتری قادر به تثبیت نیتروژن می باشد و گیاه یک منبع غیر معمول نیتروژن احیاءشده را مهیا می بیندکه یک پروسه قابل توجه و مهم اکولوژیکی و کشاورزی می باشد. ژنهای ضروری برای تشکیل گرهک ها وتثبیت نیتروژن هر دو بر روی پلاسمید حمل می شوند. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 

 فعالیتهای متابولیکی

پلاسمید ها قادرند دامنه فعالیت های متابولیکی سلول های میزبان را توسط روشهای متفاوتی توسعه دهند. برای مثال پلاسمیدی که حامل ژنهای تخمیر لاکتوز است اگر به یک سوش غیر تخمیری لاکتوز وارد شود در این صورت باکتری با این تغییرات می تواند لاکتوز را مصرف کند.چنین پلاسمید هایی می توانند باعث بروز مشکلاتی در تشخیص های آژمایشگاهی مربوط به ارگانیسم هایی شوند که شناسایی آنها بر پایه محدودیت های تنظیم کننده ویژگی های بیوشیمیایی می باشد.عموما جنس های سالمونلای بیماری زا از گونه های غیر بیماری زای E coli ، در ابتدا توسط ناتوانی سالمونلا در تخمیر لاکتوز شناسایی می شوند.در این موارد تشخیص سالمونلا های اپیدمیک جدی به تاخیر می افتد که بدلیل کسب پلاسمید مسئول تخمیر لاکتوز می باشد.

تعداد زیادی از دیگر ژنها نیز روی پلاسمید یافت می شوند که شامل تخمیر سایر قند ها همانند ساکارز،هیدرولیز اوره یا تولید H2S می باشد. بسیاری از تشخیص های ابتدایی توسط تست های بیوشیمیایی به صورت اشتباه صورت می گیرد.

 

 

تجزیه پذیری زیستی و اصلاح زیستی

انواع دیگری از پلاسمید ها که در ارتباط با فعالیت متابولیکی هستند، توانایی تجزیه توکسین های شیمیایی را به طور بالقوه دارا هستند.یک نمونه از این پلاسمید ها، pWWO می باشد که  ازputida Pseudomonas  به دست می آید و یک سری از آنزیم ها را که کربوهیدرات های حلقوی تولوئن و گزیلین را به بنزوات تبدیل می کنند را کد می کند و سپس یک اپرون ثانویه مسئول تجزیه بنزوات که از طریق شکستن حلقه کاتکول حد واسط به متابولیک های حد واسط عمل می کند را کد می کند که در این صورت برای تولیدانرژی و بیوسنتز مورد استفاده قرار گیرند ،این ارگانیسم ها می توانند با استفاده از تولوئن وقتی که به عنوان تنها منبع کربن می باشد، رشد کنند. آنزیم های روشهای بالایی اختنصاصی هستند؛پلاسمید های دیگری آنزیم های روشهای بالایی را با ویژگی های متفاوت کد می کنند که ارگانیسم را قادر می سازد مواد شیمیایی  دیگر را به بنزوات و مشتقات کاتکول تبدیل کنند و اینها نیز به وسیلهآنزیم های روشهای پایینی تجزیه شوند. پلاسمید ، میانجی تجزیه پذیری برای موادی مثل نفتالن و کامفور، ترکیبات آروماتیک کلرینیت مثل3-کلروبنزوات و علفکش D-4،2 (دی کلرو فنوکسی استیک اسید ) می باشد.

تجزیه مواد شیمیایی مخرب محیطی توانایی بالقوه مفیدی در پاک سازی مکان های آلوده می باشد (اصلاح زیستی). بنابراین در گسترش دامنه مواد شیمیایی که می توانند به وسیله میکروارگانیسم هاتوسط فعالیت های جدید ،تجزیه شوندبسیار سودمند میباشند، که این میکروارگانیسم ها هم با توسعه روشهای موجود و هم به وسیله جداسازی باکتری های غربال شده از مکان های آلوده استفاده می شوند. چنین سوشهای مفیدی همچنین پتانسیل مقاومت به یون های فلزی سمی مهم مس و جیوه را به وسیله پلاسمیدها در اختیار قرار می دهند. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 

 ویژگی های  مولکولی پلاسمید ها

پلاسمید های باکتریایی به صورت معمول درون سلول همانند مولکول های DNA حلقوی با یک کنفورماسیون بسیار فشرده ناشی از سوپر کویل DNA ، وجود دارد. در بسیاری از موارد مولکول های کاملا کوچکی هستند و فقط تعداد کمی کیلو باز در توالی خود دارند اما در برخی از ارگانیسم ها از جمله اعضای مشهور جنس Pseudomonas پلاسمید ها معمولا بیش از چند صد کیلو باز هستند. بهر حال استفاده از روش های استاندارد برای جداسازی پلاسمیدها (پایین صفحه ملاحظه شود) به طور گسترده در جداسازی DNA حلقوی بسته به طور کووالانسی و کوچک مفید می باشد و می توان وقوع پلاسمید های بزرگ یا فرم های دیگر همچون پلاسمید های خطی را ناچیز پنداشت.

نکته ای که جا دارد ذکر شود این می باشد که پلاسمید های E.coli دو نوع می باشند. گروه اول که ColE1 نمونه اولیهآن می باشد و خیلی کوچک هستند(معمولا کمتر از 10kb )که حضور آنها در سلول با تعداد کپی متعدد همراه است.همانند سازی آنها همراه در ارتباط با پروسه همانند سازی کروموزوم و تقسیم سلول نمی باشد (از این رو دارای تعدادی کپی می باشند) گر چه برخی کنترل های همانند سازی روی پلاسمید ها نیز انجام می شود. همانند سازی این پلاسمید ها می تواند تحت شرایط خاص (همانند ممانعت از سنتز پروتئین) که همانند سازی کروموزوم متوقف می شود، ادامه یابد و روند صعودی چشمگیری در افزایش تعداد کپی پلاسمید به ازای هر سلول اعطا کند. این پدیده معروف به تقویت پلاسمید (plasmid amplification ) می باشدکه برای جداسازی پلاسمید های مورد نظر بسیار مفید است.

گروه دوم پلاسمید ها که به عنوان نمونه پلاسمید های F نشان داده می شود، بزرگ تر می باشند (عموما بیش از30 kb ،خود F در حدود 100kb ) و در هر سلول یک یا دو کپی حضور دارند. که دلیل این امر کنترل همانند سازی آنها به طور ذاتی توسط برخی رو شهای کروموزمی می باشد از این رو هنگامی که یک دور همانند سازی کروموزوم شروع می شود ،همانند سازی پلاسمید به طور کامل رخ می دهد. این پلاسمید ها به دلیل پیرو بودن نمی توانند تقویت شوند. اساسا این پلاسمید های بزرگ قادرند خودشان را به وسیله انتقال با کانجوگیشن ( معروف به پلاسمید های کانجوگیتیو اند) توسعه دهند.

وجود این دو گروه می تواند بر اساس استراتژی های متفاوت بقای آنها به صورت منطقی تفسیر شود. اعضای گروه اول روی تعداد کپی بالایشان تاکید می کنند که در نتیجه تقسیم سلولی مولکول های پلاسمیدی به طور اتفاقی بین دو سلول توزیع شوند، پس هر سلول دختر واقعا حاوی حداقل یک کپی پلاسمید می باشد. برای مثال، در یک پلاسمید با 50 کپی در هر سلول، شانس این که یک سلول دختر اصلا از این پلاسمید ها کپی دریافت نکند به نسبت 1 به 10١۵ ضعیف   می باشد.

بهر حال ، تعداد کپی بالا یک محدودیت اندازه را تحمیل می کند. همانند سازی پلاسمید یک بار متابولیکی وابسته به اندازه و تعداد کپی پلاسمید را تحمیل می کند. هزینه سر بار و بار بیشتر به معنی فشار انتخابی بیشتر در جهتی است که سلول ها نمی توانند دارای پلاسمید باشند. از این رو منطقی است که برای تعداد کپی بالای پلاسمیدها، آنها نیز باید گوچک باشند. برای مثال ،ColE1 به اندازه 6/4 kb می باشد. اگر در این جا 30 کپی به ازای هر سلول باشد این مقدار نماینده حدود 4% کل DNA سلول می باشد. از سوی دیگر پلاسمید F ( (100kbاگر با همین تعداد کپی وجود داشته باشد تا نزدیک به 70%  کل محتویات DNA سلول را افزایش می دهد که به ناچار رشد سلول خیلی به کندی صورت می گیرد و سلول هایی که پلاسمید را از دست بدهند دارای یک امتیاز انتخابی خواهند بود.

اما اطلاعات مورد نیاز برای پایدار سازی کانجوگیشن در E.coli خیلی وسیع است. برای مثال پلاسمید F به اندازه حدود 30kb (پلاسمید بیش از 100kb می باشد) برای ژنهای مورد نیاز انتقال پلاسمید در نظر می گیرد.بنابر این درک می شود که پلاسمید کوچک قادر نیست همه اطلاعات مورد نیاز برای کانجوگیتیو را حمل کند.

نوع دوم پلاسمید یک استراژی متفاوت را بازمی کند. اولا ارتباط همانند سازی پلاسمید با کروموزوم مطمئن می سازدکه حداقل دو کپی پلاسمید در تقسیم سلولی در دسترس می باشد.دوما ،پارتیشن بندی اتفاقی برای مطمئن ساختن اینکه هر سلول دختر یک کپی دریافت کند مناسب نخواهد بود،بنابر این توزیع پلاسمیدباید با یک روش نظارتی مشابه روشی که کپی های کروموزوم را توزیع می کند ،انجام شود. توانایی انتقال به وسیله میسر ساختن کانجوگیشن،یک مکانیسم پشتیبان کننده از هر سلول بدون پلاسمید می باشدکه این جمعیت به وسیله نقص در مکانیسم پارتیشن بندی حاصل شده است سپس دوباره می تواند پلاسمید انتقالی را دریافت کند.

ضروری است که بدانیم گر چه این مفهوم مفید است اما بسیار ساده سازی شده است و استثنا های زیادی حتی در E.coli وجود دارد.نمونه های بیشمار پلاسمید های کوچک که دارای تعداد کپی کم هستند در حالیکه به هیچ وجه کانجوگیتیو نیستند و برخی مثال های پلاسمید های بزرگ که دارای چندین پلاسمید می باشند.بعلاوه در ارگانیسم های دیگر این مفهوم خیلی کم مشخص شده است برای مثال در استرپتومایسس ریا، پلاسمید های کاملا کوچکی می باشد که به نظر می رسد توانایی توسعه شان به وسیله انتقال با کانجوگیشن انجام می شود. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)