آزمایشگاه میکروبیولوژی و حیوانات آزمایشگاهی

اگر برای تحقیقات و کارهای خود در رشته های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار، دارید این وبلاگ کمک حال شما خواهد بود. همچنین اگر نیاز به روش های آزمایش با حیوانات آزمایشگاهی هستید و یا به تهیه حیوانات آزمایشگاهی نیاز دارید این وبلاگ به شما کمک خواهد نمود.

RNAi

 تدوین: دکتر بابک براتی

مدرس دانشگاه, مولف کتاب آزمایشگاه میکروب شناسی و متخصص در زمینه بیوتکنولوژی ، میکروبیولوژی و نانوبیوتکنولوژی

*********************************** 

فعالیتهای وبلاگ

*********************************** 

آموزش میکروبیولوژی

برگزاری سلسله کارگاه های آموزشی

میکروب شناسی ، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی

 برای دانشجویان، علاقمندان و دانش آموزان دبیرستانهای برجسته کشور

Email: barati1987@yahoo.com

دوستانی که برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و یا حتی اجرای کامل پروژه دارند و یا نیاز به آزمایش روی حیوان آزمایشگاهی و تهیه آن دارند با ایمیل یا موبایل اینجانب تماس حاصل نمایند.

  به فرازی از فعالیتها توجه نمایید:

  • طراحی و سنتز پپتیدهای (آنتی میکروبیال و ...) مورد نظر طبق درخواست شما
  • پذیرش پروژه های مستقل و مشترک در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • برگزاری کارگاههای آموزشی نیمه خصوصی، خصوصی و گروهی در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • مشاوره در انجام پروژه های بیولوژی، میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی  و نانوتکنولوژی
  • پیشنهاد طرح و راهنمایی در انجام پروژه های تحقیقاتی در زمینه های بیولوژی، میکروب شناسی، بیوتکنولوژی و نانوبیوتکنولوژی
  • تدریس و آموزش دروس آزمایشگاهی میکروب شناسی ( قارچ شناسی، باکتری شناسی، میکروبیولوژی عمومی، میکروبیولوژی غذایی، میکروبیولوژی کاربردی و ...)
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش های بیولوژی، میکروب شناسی،  سلولی و مولکولی، مهندسی ژنتیک و نانوتکنولوژی
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش با حیوان آزمایشگاهی و تهیه ( خرید - فروش ) حیوانات آزمایشگاهی( موش - خرگوش - خوکچه هندی - ... )

 اگر برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار دارید می توانید با ایمیل و یا تلفن اینجانب دکتر بابک براتی تماس حاصل نمایند.

            barati1987@yahoo.com               TEL: 09384198788

 

**********************************************************************************

 

اولين مرحله ظهور اطلاعات ذخيره شده در ماده ژنتيك موجودات زنده، رونوشت برداري از آن به صورت مولكول هاي mRNA مي باشد. هر گونه تغيير در اين روند مي تواند بيان اطلاعات ژنتيكي را تحت تاثير قرار دهد. بعلاوه تغييرات جهشي در ماده ژنتيكي به صورت تغييرات غير عادي در مولكولهاي RNA رونوشت برداري شده نماينگر مي‌شود. تمامي اين تغييرات منجر به بروز غير طبيعي صفات و نهايتاً بيماري و اختلالات ژنتيكي مي شوند. از اين رو در چند دهه گذشته تلاش دانشمندان علوم زيستي در شناسايي اساس مولكولي تغييرات جهشي كه منجر به بروز بيماري خصوصاً در انسان مي شوند متمركز شده است. در اين راستا پيشرفت هاي چشمگيري حاصل شده و راههاي درماني موثري ابداع گرديده است. بخش عمده اي از اين تحقيقات بر روي ابداع روشهاي ژن درماني معطوف گرديد كه در اين روش ها اصولاً دو هدف دنبال مي شود:

1-    جايگزيني ژن معيوب يا رونوشت هاي آنها در سلول

2-    حذف ژن ها يا رونوشت هاي ژني معيوب در سلول

در هدف دوم موفقيت هاي بيشتري حاصل شده و براي برخي از بيماري هاي ژنتيكي مراحل كلينيكي نيز آغاز شده است. با اين حال حذف هدفمند و اختصاصي يك رونوشت (RNA ) از سلول بسيار مشكل و پر هزينه مي باشد. كشف مولكولهاي RNA تداخلي كوچك به نام small interfering RNA (siRNA) منجر به ابداع تكنولوژي جديد تداخل RNA يا همان RNAi شده است كه به نظر مي رسد راه تازه اي براي حذف هدفمند و اختصاصي RNA در سلول معرفي مي نمايد كه به مراتب قوي تر از روش هاي ديگر عمل كرده و مي تواند جايگزين روش پر زحمت و وقت گير حذف ژني گردد. اين مكانيسم به علت اينكه يك تنظيم كننده ژن بعد از مرحله رونويسي مي باشد به نام كلي post transcription gene silencing (PTGS) نيز خوانده مي شود.  

تداخل RNA  يا به اختصار RNAi فرايند حفظ شده اي طي تكامل موجودات زنده به شمار رفته كه به منظور كنترل بيان ژن پس از رونويسي بكار گرفته مي شود. اين مكانيسم به صورت طبيعي دراكثر سلولهاي يوكاريوتي مختلف شناسايي شده است. اين پديده RNA هاي دو رشته اي طويل با تبديل به قطعاتي از RNA هاي كوچك دو رشته اي به نام RNA تداخلي كوچك (siRNA) توسط نوكلئاز ويژه اي به نام دايسر آغاز مي شود كه پس از تركيب با يك مجموعه پروتئيني خاموشگر القاء شده توسط RNA به نام RNA-induced silencing complex ((RISC به ريبونوكلئاز فعالي تبديل شده كه قادر به شناسايي و برش و حذف RNA رونوشت (mRNA) هدف مي باشد. به نظر مي رسد اين عمل در موجوداتي مثل تريپانوزوم و گياهان در جهت حفاظت از ژنوم باشد. مطالعات اخير حاكي از وجود پديده مشابهي در سلول هاي پستانداران مي باشد. اخيراً با ايجاد مولكولهاي ساختگي siRNA و بيان آن توسط ناقل هاي مناسب راه تازه اي براي كنترل بيان ژن ها و نيز درمان سرطان ها و مبارزه با آلودگي هاي ويروسي و ژن درماني به روي بشر گشوده شده است. كه مي تواند جايگزين روش هاي آنتي سنس و حذف ژني گردد.

اگر بخواهيم از ژن درماني يك تعريف كلي داشته باشيم مي توانيم اينگونه بگوييم كه هر روشي كه منجر به درمان و يا خفيف كردن بيماري از طريق تغيير و تعديل در ژنتيك سلول هاي بيمار صورت گيرد را ژن درماني مي گويند. ژن درماني بر خلاف روش هاي درماني مبتني بر مواد شيميايي داراي عوارض جانبي نبوده و به صورت بسيار اختصاصي عمل مي كند و به سلول هاي سالم آسيب وارد نمي كند.  ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

امروزه از چندين تكنيك براي امر ژن درماني استفاده مي شود كه عبارتند از:

1- استفاده از تكنيك آنتی سنس اليگودئوكسي ريبونوكلئوتيد (سنس آنتي سنس)  

2- استفاده از ریبوزیم

3- استفاده از تکنیک RNAi

دو تكنيك اول در زمينه ژن درماني در حدود 40 ال 50 درصد موفق بوده است يعني توانسته است ژن مورد نظر را خاموش كند ولي در تكنيك RNAi اين موفقيت به حدود 90 درصد رسيده است لذا نسبت به تكنيك هاي ديگر موفق تر بوده است لذا امروزه مي بينيم كه به وفور از اين تكنيك براي امر ژن درماني استفاده مي شود.  

تكنولوژي RNAi

تداخل RNA (RNAi) مكانيسمي طبيعي و حفظ شده طي فرايند تكامل موجودات زنده است كه از شكسته شده مولكول هاي RNA دو رشته اي بزرگ و تبديل ان به مولكول هاي RNA تداخلي كوچك شروع مي شود. مولكولهاي siRNA با اتصال به يك مجموعه پروتئيني خاموشگر القاء شده توسط RNA (RISC) به ريبونوكلئاز فعالي تبديل شده كه قادر به شناسايي مولكول هاي mRNA هدف و تخريب و از بين بردن آنها و مهار رونويسي در مرحله پس از رونويسي مي شود. اين مكانيسم اولين بار در Ceanorhobids elegans توسط Andrew Fire  در سال 1998 به عنوان روشي براي سركوب ترانسپوزون هاي متحرك و جلوگيري از تجمع توالي هاي تكراري DNA شناسايي شد كه داراي اهميت ويژه اي در حفاظت از ژنوم اين موجود مي باشد. بررسي جهش هايي در ژن هاي موثر در عمل RNAi كه باعث غير فعال شدن سيستم مزبور شده نشان دهنده ارتباط بين عمل RNAi و تكامل C. elegans مي باشد. به طوري كه نقص در مكانيسم RNAi در اين موجود منجر به اختلال در سلول هاي زاينده فرايند اووژنز مي شود. اين مكانيسم سپس در دروزوفيلا، تريپانوزوم، قارچها، گياهان و نهايتاً در پستانداران شناسايي شد. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

در گياهان مولكول هاي siRNA داراي نقش فيزيولوژيك در پاسخ ضد ويروسي مي باشند. بررسي نقش RNAi در سلول هاي سوماتيك پستانداران با يك چالش بزرگ مواجه بوده است. زيرا RNA هاي دو رشته اي بلند سبب بروز يك سري پاسخ التهابي در پستانداران مي شوند در اين راستا مطالعات اوليه نشان دادكه وارد كردن siRNA هاي كمتر از 30 نوكلئوتيد در سلول پستانداران در محيط كشت پاسخ هاي ضد ويروسي را به همراه ندارد و مي تواند منجر به مهار اختصاصي ژن شود. اين مطالعات نشان دادند كه siRNA مي تواند به عنوان يك ابزار مناسب در تحقيقات عملكردي ژن ها بكار گرفته شود. در اين ارتباط در فاصله كمي گزارشات متعددي از استفاده اختصاصي و موثر siRNA در بيان ژن هاي انساني مرتبط با بيماري هاي مختلف منتشر شد. همچنين مطالعات انجام شده در اين زمينه نشان دادند كه اثر مهار كنندگي اختصاصي مولكولهاي siRNA در مقايسه با روش هاي قبل موثر بوده و در بسياري موارد قابليت عملكردي قوي تري نسبت به روش هاي آنتي سنس اليگونوكلئوتيد مي تواند داشته باشد. نظر به گسترش روز افزون استفاده از روش RNAi در تحقيقات بيولوژي مولكولي و پزشكي در زير به معرفي مكانيسم مولكولي و سيستم مزبور و برخي از كاربرد هاي آن مي پردازيم. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

كاربرد هاي RNAi

توانايي بالاي سيستم RNAi در مهار اختصاصي بيان ژن منجر بهتوجه محققان مختلف علوم زيستي و پزشكي به كاربرد سيستم مزبور در مطالعه و درمان بيماري هاي مختلف شده است. از جمله كاربرد هاي سيستم RNAi مي توان به موارد زير اشاره نمود:

  • كنترل بيان ژن در مرحله پس از رونويسي
  • مطالعه عملكرد ژن هاي مستقل و خانواده هاي ژني در سلول هاي مختلف
  • مطالعه فنوتيپ حاصله از يك ژن يا يك خانواده ژني
  • مطالعه چندين ژن غير مرتبط و بررسي اثر اپيستازي
  • مطالعه بيماري هاي انساني و درمان بيماري هاي عفوني و ويروسي

در زير برخي از كاربرد هاي RNAi و siRNA در زمينه پزشكي به اختصار مورد بررسي قرار مي گيرد.

مطالعه مولكولي بيماري هاي خوني

سيستم RNAi براي شناسايي نقش آنزيم ها و پروتئين هاي مختلف در واكنش هاي فيزيولوژي مورد استفاده قرار گرفته است. در مطالعه اي از طريق RNAi نقش بيلي روبين به عنوان يك آنتي اكسيدان فيزيولوژيك در بافت خون مشخص شده است. بدين صورت كه با تهي سازي سلول هاي سفيد خون از آنزيم بيلي وردين ردوكتاز با روش RNAi مشاهده شده است سلولهايي كه به طور مشخص از سطح اكسيژن فعال برخوردار باشند دچار مرگ سلولي و آپوپتوز مي شوند. اين مسئله نشان دهنده نقش انزيم مزبور در فعاليت هاي آنتي اكسيداني سلول است. در مطالعه اي ديگر ناهنجاري ژنتيك خوني كمبود گلوكز 6-فسغات دهيدروژناز مورد بررسي قرار گرفته است. در اين مطالعه با حذف ژن آنزيم فوق در موش مدل آزمايشگاهي مناسب ايجاد شده است. اين مدل علاوه بر فراهم نمودن امكان مطالعه بيماري مزبور مي تواند در ايجاد راههاي درماني و كشف داروهاي جديد موثر باشد.

مطالعه سرطاني مولكول ها و تومورها

تكنولوژي RNAi به طور موفقيت آميزي در مطالعه مولكولي سرطان مورد استفاده قرار گرفته است. و به نظر مي رسد بتواند به عنوان يك روش ژن درماني موفق براي بسياري از سرطان ها مطرح گردد. در مطالعات متعددي با استفاده از سيستم RNAi موتان هاي غالب انكوژن ها و انكوژن هاي تكثير يافته محصولات جابجا شونده آن ها و انكوژن هاي ويروسي در سرطان ها و تومورهاي مختلف مورد هدف قرار گرفته اند. در اين مطالعات ديده شده كه روش مزبور در مقايسه با روش هاي آنتي سنس از توانايي بيشتري برخوردار است. همچنين با استفاده از مولكول هاي siRNA نقش مولكولهاي سيگنالي مختلف از جمله NF-Kappa B در تومور زايي مورد مطالعه قرار گرفته است. در مطالعات ديگر با استفاده از RNAi ژن هاي انكوژن ويروسي مورد هدف قرار گرفته و تكثير آنها مهار شده است. براي مثال مهار ژن هاي ويروسي 6E و 7E از ژن HPV در سلول هاي آلوده با ويروس پاپيلوما توسط RNAi منجر به كاهش چشمگير رشد تومور شده است. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

بيولوژي سلول هاي بنيادين

امروزه ژن درماني توسط سلول هاي بنيادين عرصه ديگري براي siRNA فراهم آورده است. با هدف قرار دادن سلول هاي بنيادين پلوريپوتنت، مزانشيمي و جنيني غير تمايز يافته اثر مهار ژني بااستفاده از تكنولوژي RNAi به طور گسترده در تكامل و تمايز بافت هاي مختلف در حيوانات آزمايشگاهي ديده شده است. در اين مطالعات RNAi به طور اختصاصي منجر به مهار بيان ژن در سلول هاي بنيادين و اندام هاي تكيل شدنده از آنها شده است. همينطور يكي ديگر از كاربردهاي RNAi در سلول هاي بنيادين توليد بافت هايي است كه فاقد آنتي ژن خاصي هستند و براي پيوند مي توانند استفاده شوند. ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

درمان بيماري هاي عفوني و ويروسي

علاوه بر توانايي siRNA در درمان تومور ها از آن براي مبارزه با بيماري هاي قارچي، انگلي و ويروسي نيز استفاده شده است. تئوري ساخت سلول هاي مقاوم به موجودات الوده كننده منجر به ايجاد كاربرد هاي siRNA در اين حيطه شده است. اكنون RNAi و siRNA براي مهار فاكتورهاي ويروسي و سلولي كه باعث جاودانگي بيماري ايدز مي شود بكار مي روند. مهار همانند سازي HIV-1 با بكارگيري siRNA عليه پروتئين tat اين ويروس موثر بوده است. همينطور پروتئين هاي ديگر HIV مثل rev و gag مورد هدف قرار گرفته است. از ديگر اهداف RNAi ويروس انفلوآنزا بوده است كه به صورت تشكيل siRNA عليه نوكلئوكپسيد و RNA ترانس كريپتاز آنفلوآنزا استفاده مي شود.       ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

p53 mutant

K-Ras

BCR-ABL

MDR1

C-RAF

Bcl-2

VEGF

PKC-a

Β-Catenin

       ژنهاي سرطاني

HIV-Tat

HIV-Rev

HIV-Vif, -Hef

HPV-E6 and –E7

HBV-S1, -S2, -S, -X

CCR5, CXCR4

CD4

Influenza

عفونت هاي ويروسي

Fas receptor

Caspase-8

آسيب كبدي حاد

TNF-a

سپسيس

 

تعدادي از ژنها كه توسط مكانيسم RNAi بيان آنها مهار شده است