همانند سازی و کنترل پلاسمیدهای حلقوی باکتریایی

همانند سازی و کنترل پلاسمیدهای حلقوی باکتریایی

 

  تدوین: دکتر بابک براتی

مدرس دانشگاه, مولف کتاب آزمایشگاه میکروب شناسی و متخصص در زمینه بیوتکنولوژی ، میکروبیولوژی و نانوبیوتکنولوژی

 

*********************************** 

 

فعالیتهای وبلاگ

 

*********************************** 

 

آموزش میکروبیولوژی

 

برگزاری سلسله کارگاه های آموزشی

 

میکروب شناسی ، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی

 

 برای دانشجویان، علاقمندان و دانش آموزان دبیرستانهای برجسته کشور

 

Email: barati1987@yahoo.com

 

دوستانی که برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و یا حتی اجرای کامل پروژه دارند و یا نیاز به آزمایش روی حیوان آزمایشگاهی و تهیه آن دارند با ایمیل یا موبایل اینجانب تماس حاصل نمایند.

 

  به فرازی از فعالیتها توجه نمایید:

 

  • طراحی و سنتز پپتیدهای (آنتی میکروبیال و ...) مورد نظر طبق درخواست شما
  • پذیرش پروژه های مستقل و مشترک در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • برگزاری کارگاههای آموزشی نیمه خصوصی، خصوصی و گروهی در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • مشاوره در انجام پروژه های بیولوژی، میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی  و نانوتکنولوژی
  • پیشنهاد طرح و راهنمایی در انجام پروژه های تحقیقاتی در زمینه های بیولوژی، میکروب شناسی، بیوتکنولوژی و نانوبیوتکنولوژی
  • تدریس و آموزش دروس آزمایشگاهی میکروب شناسی ( قارچ شناسی، باکتری شناسی، میکروبیولوژی عمومی، میکروبیولوژی غذایی، میکروبیولوژی کاربردی و ...)
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش های بیولوژی، میکروب شناسی،  سلولی و مولکولی، مهندسی ژنتیک و نانوتکنولوژی
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش با حیوان آزمایشگاهی و تهیه ( خرید - فروش ) حیوانات آزمایشگاهی( موش - خرگوش - خوکچه هندی - ... )

 

 اگر برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار دارید می توانید با ایمیل و یا تلفن اینجانب دکتر بابک براتی تماس حاصل نمایند.

 

            barati1987@yahoo.com               TEL: 09384198788

 

 

 

**********************************************************************************

 

 

همانند سازی و کنترل پلاسمیدهای حلقوی باکتریایی

 

تدوین : دکتر بابک براتی  

 

چکیده

 یکی از ویژگی های اصلی پلاسمیدهای باکتریایی این است که قادرند به صورت اجزای ژنتیکی و به طور کنترل شده در داخل سلول میزبان همانند سازی نمایند. بنابراین می توان از این پلاسمیدها برای شناسایی مکانیسم های موجود در همانند سازی DNA و بررسی پل های ارتباطی میان همانند سازی DNA و سایر وقایع مهم در چرخه سلولی استفاده نمود. در این مقاله ، همانند سازی و کنترل آن در پلاسمیدهای حلقوی مورد بحث قرار گرفته است.  همانند سازی پلاسمید دارای سه مرحله است : شروع ،‌ ادامه و پایان. ناتوانی آنزیم های DNA پلیمراز برای شروع همانند سازی ... سبب می شود تا نیاز به ساخت یک پرایمر مجزا به وجود آید. این مشکل در پلاسمیدهای حلقوی  به دو صورت برطرف شده است :

 1) باز شدن رشته ها و ساخت پرایمر RNA (همانند سازی تِتا و همانند سازی جابجایی رشته ها)  

 2) بریده شدن یکی از رشته های DNA برای ایجاد یک انتهای OH-3 (همانند سازی حلقه چرخان)           

 

 مرحله شروع همانند سازی اغلب به واسطه یک یا چند پروتئین آغازگر کُد شده توسط پلاسمید انجام می شود. این پروتئین ها ، توالی های DNA ای خاصی را بر روی پلاسمید شناسایی و نقطه آغاز همانندسازی (یا مبدأ همانند سازی) را تعیین می نمایند. در برخی موارد این پروتئین ها به طور مستقیم در ساخت پرایمر نیز شرکت می کنند. همچنین این پروتئین های آغازگر می توانند نقش یک راهنما را در تشکیل مجموعه همانند سازی  (Replisome) میزبان در نقطه آغاز ایفا نمایند. مرحله ادامه همانند سازی پلاسمیدها اساساً توسط DNA پلیمراز III (و در برخی موارد توسط DNA پلیمراز I در مراحل اولیه) و سایر پروتئین های موجود در مجموعه همانند سازی میزبان صورت می گیرد. پایان همانند سازی دارای مفاهیم و نیازمندی های خاصی برای شروع مجدد همانند سازی است که مطالعه درباره آن ها آغاز شده است. مرحله آغاز همانند سازی دارای نقش کنترلی نیز می باشد زیرا   مکانیسم های کنترل همانند سازی در این مرحله صورت می گیرد. هدف از این کنترل آن است که غلظت  مولکول های پلاسمیدی در توده باکتریایی در حال رشد ثابت نگه داشته شود و یا به عبارت دیگر همانند سازیمخزن پلاسمیدی هم گام با همانند سازی توده باکتریایی صورت گیرد. مولکول هایی که به طور مستقیم در کنترل همانند سازی پلاسمید دخیل هستند عبارتند از :

 1) RNA مکمل (Antisense RNA) و توالی های DNA ای (ایترون ها [Iteron])

   یا

 2) RNA مکمل و پروتئین های دخیل در کنترل همانند سازی

 

 مولکول های کنترلی بر طبق نسخه های پلاسمیدی موجود ، میزان همانند سازی پلاسمید در هر چرخه سلولی را در حد وسط نگه داشته و می توانند هر گونه انحراف از این میزان را شناسایی و متعادل نمایند. اکثر اطلاعات جدید درباره همانند سازی پلاسمید و کنترل آن بر اساس نتایج بررسی هایی می باشد که بر روی کشت خالص باکتری ها  تحت شرایط ثابت رشد صورت گرفته است. این اطلاعات در شناخت پارامترهای مهم مورد نیاز برای درک ابقاء  این عناصر ژنتیکی در توده های مختلط باکتریایی و تحت شرایط محیطی مؤثر می باشد.     ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

 

 مقدمه

 پلاسمیدها ، مولکول های DNA خارج کروموزومی هستند که دارای ویژگی تعداد رونوشت ها در سلول میزبان   می باشند. این واحدهای قابل همانند سازی در گونه هایی از سه سلسله موجودات زنده جهان یعنی باکتری ها ،  آرکی باکترها و یوکاریوت ها یافت شده اند. ممکن است پلاسمیدها مقدار قابل توجهی از کل محتوای ژنومی یک موجود زنده را تشکیل دهند ، به طور مثال بیش از 25 درصد از ماده ژنتیکی سلول در برخی از اعضای سلسله آرکی باکترها از پلاسمید تشکیل شده است. پلاسمیدها قادرند توسط نوترکیبی یا ترانهش (Transposition) ، ژن ها را در کنار یکدیگر قرار داده و منتقل نمایند و در نتیجه باعث تغییرات ژنتیکی در توده های باکتریایی شوند. به دلیل این که پلاسمیدها قادرند توسط مکانیسم های گوناگون وارد  میزبان های جدید شوند می توان آن ها را یک مخزن DNA خارج کروموزومی در نظر گرفت که بین توده های مختلف باکتریایی به اشتراک گذاشته شده است. وفور اطلاعات ژنتیکی حمل شده توسط پلاسمیدها ، تأثیر آن ها در اجتماعات میکروبی و پتانسیل این عناصر برای استفاده به عنوان ناقل های طبیعی کلونینگ باعث افزایش تحقیقات   (نه تنها تحقیقات بنیادی بلکه پژوهش های بالینی ،‌ زیست فناوری و محیطی) بر روی پلاسمیدها شده است. سه فاکتور مهم در توسعه تحقیقات بر روی پلاسمیدها عبارت است از :

 1) سازماندهی ژنتیکی پلاسمیدها به طور آشکارا ساده می باشد.

 2) می توان پلاسمیدها را به راحتی تخلیص و در محیط خارج از سلول(in vitro) دست ورزی نمود.              

 3) به دلیل این که پلاسمیدها ، عناصر غیر ضروری هستند در نتیجه دستکاری آن ها آشکار نمی شود و در واقع دارای عواقب زیان آور برای سلول های میزبان نمی باشد.

  ویژگی که باعث توصیف بهتر پلاسمیدها می شود این است که پلاسمیدها به طور مستقل و تحت کنترل پلاسمیدی همانندسازی می کنند. بررسی همانندسازی پلاسیمدها و فرآیند کنترل همانندسازی آن ها منجر به کشفیات برجسته (همانند وجود antisense RNA ها) و درک مکانیسم های موجود در همانندسازی DNA ، اندرکنش های ماکرومولکولی و مکانیسم کنترل بیان ژن شده است. توانایی برخی پلاسمیدها برای عبور از میان موانع ژنتیکی موجود در میان موجودات زنده گوناگون باعث مطرح گردیدن مسائلی درباره مکانیسم های کلی حاکم بر همانندسازی و ارتباط میان فاکتورهای همانندسازی پلاسیمد و دستگاه همانندسازی DNA سلول میزبان شده است. این ارتباط میان میزبان و پلاسمید باعث جلب توجه پژوهشگران حوزه تکامل و محیطی شده است. همچنین حوزه های  میکروب شناسی بالینی و زیست فناوری آشکارا نیازمند تحقیقات بر روی محدوده میزبان پلاسمیدها هستند. پلاسمیدها علیرغم همانندسازی مستقل ، به طور گسترده از دستگاه همانندسازی سلول میزبان استفاده می کنند. از اینرو مطالعه همانندسازی آن ها به شناسایی مکانیسم های موجود در همانندسازی کروموزوم کمک خواهد نمود.

 

مکانیسم های همانندسازی پلاسیمد

 سه مکانیسم کلی همانندسازی برای پلاسمیدهای حلقوی وجود دارد که عبارتند از : مکانیسم تِتا ، تعویض زنجیره و حلقه چرخان (RC). افزایش سابقه تحقیقات بر روی پلاسمیدها منجر به ایجاد این تفکر عمومی شده است که همانندسازی تتا بیشتر در واحدهای همانندسازی باکتری های گرم منفی صورت می گیرد تا باکتری های گرم مثبت و عکس این موضوع در مورد همانندسازی به روش حلقه چرخان دیده می شود. این باور احتملاً نادرست است. البته   به دلیل این که در حال حاضر دانش ما از همانندسازی تتا و حلقه چرخان به ترتیب بر پایه مطالعات بر روی واحدهای همانندسازی باکتری های گرم منفی و باکتری های گرم مثبت است می توان گفت که این اعتقاد صحیح است. همانندسازی تعویض زنجیره در پلاسمیدهای وسیع الطیف (دارای محدوه میزبانی وسیع) خانواده IncQ  دیده می شود. اندرکنش های مولکولی و ارتباطات عملکردی این سه نوع مکانیسم همانندسازی ، موضوعات اصلی  این مقاله هستند. پلاسمیدهای خطی هم در باکتری های گرم منفی و هم در باکتری های گرم مثبت یافت شده و دارای دو نوع ساختار هستند : پلاسمیدهای دارای یک ساختار سنجاق سر در هر انتها و پلاسمیدهایی که یک پروتئین به طور کووالانسی به انتهای5 آن ها متصل شده است. پلاسمیدهای خطی گروه اول توسط ساختارهای حدواسط   به هم پیچیده یا concatemeric و پلاسمیدهای گروه دوم ظاهراً توسط یک مکانیسم ایجاد پرایمر به واسطهپروتئین ها (شبیه به مکانیسم همانندسازی باکتریوفاژ Φ29) همانندسازی می کنند. البته شروع همانندسازی از یک نقطه آغاز داخلی در یک پلاسمید دارای پروتئین انتهایی گزارش شده است. پلاسمیدهای خطی قبلاً نیز مرور شده اندو در این مقاله مورد بحث قرار نخواهند گرفت. همانندسازی پلاسمید باکتری های گرم منفی به طور اختصاصی مورد بررسی قرار گرفته است.

 پلاسمیدها از لحاظ ساختار ژنتیکی دارای مناطق ضروری هستند که حاوی ژن ها یا موقعیت های ژنی دخیل در همانندسازی و کنترل آن می باشند. به طور کلی سازماندهی این مناطق ضروری شبیه سازماندهی ژنتیکی است که در مدل واحد همانندسازی یا reolicon توضیح داده شده است. علاوه براین پلاسمیدها ممکن است حاوی ژن هایی باشند که به صورت غیر ضروری در نظر گرفته می شود ولی در واقع این ژن ها می توانند برای عملکرد پلاسمید و  یا سلول میزبان مهم باشند. برخی از این ژن ها که غیر ضروری نامیده می شوند در فرآیندهایی مانند انتقال پلاسمید و گسترش آن در میان باکتری ها ، مقاومت به آنتی بیوتیک ها و فلزات سنگین ، مقاومت به تشعشعات رادیولوژیک و انتقال DNA به یوکاریوت های پیشرفته تر دخیل می باشند. در داخل منطقه ضروری پلاسمید می توان چندین ژن و توالی را مورد بررسی قرار داد :

 1) نقطه یا نقاط شروع همانندسازی (نوعاً oriنامیده می شود) که یکی از مشخصات هر واحد همانندسازی است.  

 2) بسیاری از پلاسمیدها ، پروتئینی را کد می کنند که در آغاز همانندسازی دخیل است و معمولاً پروتئین Rep  نامیده می شود. (این موضوع یک ویژگی کلی نمی باشد)

 3) ژن های پلاسمیدی که در کنترل همانندسازی پلاسمید دخیل می باشند.         

 وجود جایگاه های ... در ناحیه شروع همانندسازی که محل اندرکنش های پروتئین-DNA است نشان می دهد که یک آغازگر کد شده توسط پلاسمید مورد نیاز می باشد. این جایگاه های اختصاصی ، شاخص رده ای از واحد های همانندسازی است که با واحدهای همانندسازی بدون نیاز به آغازگرهای اختصاصی تفاوت دارند.       ........................ (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

/ 0 نظر / 24 بازدید