واکنش زنجیرهای پلیمراز Polymerase Chain Reaction

واکنش زنجیرهای پلیمراز          Polymerase Chain Reaction - PCR 

  تدوین: دکتر بابک براتی

مدرس دانشگاه, مولف کتاب آزمایشگاه میکروب شناسی و متخصص در زمینه بیوتکنولوژی ، میکروبیولوژی و نانوبیوتکنولوژی

**************************************

فعالیتها

*********************************** 

آموزش میکروبیولوژی

برگزاری سلسله کارگاه های آموزشی

میکروب شناسی ، بیوتکنولوژی ، نانوبیوتکنولوژی

 برای دانشجویان، علاقمندان و دانش آموزان دبیرستانهای برجسته کشور

Email: barati1987@yahoo.com

دوستانی که برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و یا حتی اجرای کامل پروژه دارند و یا نیاز به آزمایش روی حیوان آزمایشگاهی دارند با ایمیل یا موبایل اینجانب تماس حاصل نمایند.

  به فرازی از فعالیتها توجه نمایید:

  • طراحی و سنتز پپتیدهای (آنتی میکروبیال و ...) مورد نظر طبق درخواست شما
  • پذیرش پروژه های مستقل و مشترک در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • برگزاری کارگاههای آموزشی نیمه خصوصی، خصوصی و گروهی در زمینه های میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی میکروبی و نانوبیوتکنولوژی
  • مشاوره در انجام پروژه های بیولوژی، میکروبیولوژی، بیوتکنولوژی و نانوتکنولوژی
  • پیشنهاد طرح و راهنمایی در انجام پروژه های تحقیقاتی در زمینه های بیولوژی، میکروب شناسی، بیوتکنولوژی و نانوبیوتکنولوژی
  • تدریس و آموزش دروس آزمایشگاهی میکروب شناسی ( قارچ شناسی، باکتری شناسی، میکروبیولوژی عمومی، میکروبیولوژی غذایی، میکروبیولوژی کاربردی و ...)
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش های بیولوژی، میکروب شناسی، سلولی و مولکولی، مهندسی ژنتیک و نانوتکنولوژی
  • ارائه روش کار و چگونگی انجام آزمایش با حیوان آزمایشگاهی

 اگر برای تحقیقات و کارهای خود نیاز به مشاوره، راهنمایی و توضیح روش های کار دارید می توانید با ایمیل و یا تلفن اینجانب دکتر بابک براتی تماس حاصل نمایند.

            barati1987@yahoo.com               TEL: 09384198788

 

**********************************************************************************

واکنش زنجیرهای پلیمراز

 Polymerase Chain Reaction - PCR 

 روش PCR توسط مولیس کارمند شرکت Cetus ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلینو بعنوان DNA polymerase  استفاده میشد. این آنزیم در اثرحرارت  دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم   DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase  گفته میشود استفاده کرد وامروزه واکنشPCR  بصورت اتوماتیک انجام میگیرد.

 

تعریف

واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی است که قسمتی از سکانس مولکول DNA که بین دو پرایمر قرار دارد توسط آنزیم پلیمراز وبه کمک چهار داکسی نوکلئوتید تری فسفات در آزمایشگاه تکثیر (Amplify) میشود. .dsDNA متشکل از دو رشته آنتی پارالل میباشد که توسط اتصالات هیدروژنی وبصورت کووالانت به یکدیگر متصل هستند.

همانند سازی DNA به کمک الیگو نوکلئو تید هایی که پرایمر گفته میشوند انجام میگیرد. الیگونوکلئوتیدها مولکولهای  DNA تک رشته کوتاه هستند که هر کدام از آنها مکمل یک انتهای سکانس DNA هد ف ( الگو ) می باشند.

پرایمر ها توسط آنزیم DNA پلیمراز و در حضور  dNTPها از روی DNA الگو ( تک رشته ای است ) همانند سازی میکنند و رشته های جدیدی مکمل رشته های هدف سنتز میگردد.

 

 مراحل یک سیکل PCR

 1- مرحله Denaturation  : در این مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تک رشته ای میشود. (95-93درجه )

  2- مرحله Annealing : در این مرحله با کاهش حرارت سیستم ، پرایمر ها در محل مناسب روی رشته الگو متصل میشوند (65-50درجه )

  3- مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای آنزیم DNA پلیمرازمطلوب میباشد موجب توسعه پرایمر ها شده و همانند سازی DNA هدف انجام میگیرد. محصول PCR عبارت است از قطعه همانند سازی شده ای که دو طرف این قطعه سکانس پرایمر ها وجود دارند (72درجه ).

 

 فاکتور هایی که روی کار آیی PCR  تاثیر دارند

 1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال میشود

 2- غلظت زیادرشته های هدف موجب Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .

 

پارامتر های موثر در PCR

1- زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد

2- دمای  Annealing پرایمرها که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد

3- زمانPrimer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد

4- - تعداد سیکلها

5- Ramp time ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیجه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد

6- غلظت dNTP ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )

7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.

8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR 

10- حذف مهارکننده های آنزیم از محیط

11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد ( Tm یکسان داشته باشند).

 

طراحی پرایمر :

پرایمر ها ی PCR بصورت کاملا" اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظر DNA هدف طراحی میگردند. پرایمر ها 30-20 بازدارند و پرایمر های بیش از 30 باز اختصاصیت خوبی ندارند. همچنین پرایمر باید دمای اتصال بالا داشته باشد. بهتر است تعداد بازهای دوپرایمر مساوی باشند و از پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند، همچنین نواحی تکرار شونده نداشته باشند چنانچه بازهای G یا C بصورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر بصورت لوپ در می آید و عملا" سیستم کار نمیکند. انتهای 3` دو پرایمر نباید مکمل باشد زیرا پرایمر دایمر تشکیل میشود.

نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام میدهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است توسط نرم افزارهایی مانند Blast  آنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیگر میتوانندAnneal گردند......................... (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

  

 

 چگونگی رد یابی ( detect )   محصول PCR 

1- هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار ( پروب )

2- الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی اکریلامید

 

 

انواع PCR  ( بمنظور تصحیح محصول )

 

1- Hot start PCR : عبارت است از جدا کردن یک یا چند ترکیب مهم PCR ( ترجیحا" انزیم پلیمراز) بطوریکه بلا فاصله بعد از دناتوراسیون DNA هدف به واکنش اضافه میشوند ( استفاده از , PCR gem و آنتی بادی آنزیم پلیمراز )

2- Touch down PCR : در این روش دمای آنیلینگ ازدمای بالاتر از Tm بندرت کاهش میابد وموجب کاهش محصول کاذب و پرایمر دایمر میشود.

3- Nested PCR : مواقعی که DNA هدف در نمونه مورد آزمایش کم باشد برای جلوگیری از بالابردن مقدار DNA و مهار واکنش توسط پرایمر های خارجی قطعه طویلتری همانند سازی میشود و از محصول PCR اول که بیشتر DNA هدف همانند سازی شده است یک واکنش دیگر با پرایمر های داخلی انجام میگیرد. در این روش اختصاصیت و حساسیت PCR بالا میرود.

4- Long distance PCR : با این روش قطعات بیش از 2 kb همانند سازی میشوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشدو پرایمر ها به دقت طراحی شوند. برای اینکاراز آنزیم Long distance DNA Polymerase  استفاده میشود......................... (جهت حفظ اختصار بقیه مطالب حذف شده است!)

/ 0 نظر / 46 بازدید